服务简介

数字PCR(digitalPCR,dPCR)是近年来引起重视并迅速发展 起来的一种突破性的定量分析技术。1992年Sykes等检测复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因时,利用样品的有限稀释,让每个孔中只获得单个模板分子,通过计算PCR后的扩增信号,以期准确地确定起始分子的数量,虽然没有明确提出“数字PCR”的概念,但是已经建立了数字PCR基本的实验流程,并且确定了数字PCR检测中一个极其重要的原则——以“终点信号的有或无”作为定量方法。这是数字PCR的雏形。1999年Vogelstein等在检测粪便中进行癌变组织脱离细胞的BRAF特异突变型基因时,因受到体细胞基因的干扰,而碰到检测灵敏度和检测分辨率的瓶颈,而采用了在384孔板中对每个反应孔的样品量进行极限稀释并增加反应孔数进行检测的方式,从而提出了数字式PCR的概念,同时也提出如果采用更多孔板其检测灵敏度会更高,从而指出了数字PCR系统的发展方向。

原理

标准PCR反应体系经过微滴发生后,分配到约20000个微滴中,每个微滴包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板),实现”单分子模板PCR扩增”,扩增结束后,含有核酸分子模板的微滴会给出荧光信号,没有模板的微滴就没有荧光信号产生。最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例,分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数,因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测;此外,由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态,因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点,完全不依赖于Ct值的鉴定,因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低,对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高;数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度。计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。

ddpcr

应用领域

领域具体方向
临床诊断无创产前诊断
癌症标志物检测
病毒检测
拷贝数变异分析
基因表达分析基因表达分析
单细胞基因表达分析
二代测序测序结果验证
测序文库质控
转基因成分定量转基因成分分析
微生物检测水样微生物检测
病原微生物检测

临床应用领域:

肿瘤早期筛查
微滴式数字PCR技术作为迄今为止最灵敏的检测肿瘤细胞突变DNA的手段,可有效应用于肿瘤的早期筛查。微滴式数字PCR技术可以通过检测患者外周血样对进入外周血循环的肿瘤组织核酸进行分析,相对于传统的PCR检测方法,有更高的灵敏度,可以更好的胜任稀有变异检测的工作,实验数据证实微滴式数字PCR可以实现0.001%的突变频率筛查。
肿瘤病理学辅助诊断
微滴式数字PCR的一个主要优势是所需样本量很低,这对于临床来说特别有意义,尤其是当病理样本太少时,DDPCR可以帮助检测突变,来辅助诊断对药物的敏感性。另外在肿瘤均质细胞内检测单一突变相对简单,但是如果在异质细胞内,在仅存有少量携带突变肿瘤细胞的情况下,突变的特定等位基因是否可以被准确检测到,直接影响到靶向治疗是否有效。微滴式数字PCR 在进行突变/稀有变异检测中发挥着重要的作用,是临床肿瘤样本靶向药物分子检测的不二之选。

肿瘤负荷的实时监控
微滴式数字PCR技术由于可以检测外周血循环细胞中微量肿瘤细胞突变DNA,成为进行肿瘤负荷实时监控的有效手段,判断患者体内肿瘤细胞负荷更加科学、可靠、及时。
药物耐药突变外周血监控
目前,许多肿瘤常规化疗效果差,预后不良是困扰临床的重要难题,而肿瘤多药耐药性则是肿瘤化疗失败的关键因素。经治疗后,残存的肿瘤干细胞耐药性形成,常导致对某些药物治疗敏感性降低,并引起肿瘤复发甚至转移,因此,对药物耐药突变的筛选和监控成为当今医学界研究的热点。

技术优势

通过把样本稀释成许多部分,然后在一个反应发生的时候对其进行计数。其灵敏度高达0.001%,显著高于扩增阻滞突变系统(0.1%)和Sanger法测序(10%)。同时能克服核酸降解的不利影响,非常适合一些稀有样本中核酸的精确检测。

1.高灵敏度、高特异性检测复杂背景下的靶标序列
灵敏度可达0.001%,样本珍贵或者样本核酸存在降解时的最佳选择。在穿刺样本、胸腹水、外周血中即可完成靶标序列的检测。
2.所需样本量少
200ul血浆或1ml全血/  2-3片白片/  纳克级活检组织。
3.实验数据分析便捷
每个微滴的检测结果以阴性、阳性判读,数据分析自动化。
4.可统计突变率
真正意义上的绝对定量,通过统计分析可得出靶点的突变率。

实验路线

ddpcr-process

实验仪器

QX200TMDroplet DigitalTM PCR

ddpcr2

送样要求

样品类型送样要求
DNA样本纯度OD260/280 比值为 1.6-1.8,浓度≥10 ng/μl,体积≥20μl,干冰运输
RNA样本纯度OD260/280 比值为 1.8-2.0,浓度≥20 ng/μl,体积≥20μl,干冰运输
血液样本样品为EDTA抗凝或枸椽酸钠抗凝,样品量大于0.5 ml,样品采集后于-20°C或-80°C保存,低温(≤-4°C)运输
组织样本样品可以为新鲜组织(最好-80°C保存)或石蜡包埋的组织,也可以是95%乙醇中固定的组织,组织量大于100 mg。干冰运输。

结果报告展示

ddpcr-analysis-results

参考文献

[1] C Floren,I Wiedemann,et al.Species identification and quantification in meat and meat products using Droplet Digital PCR (ddPCR).Food Chemistry. 2015, 173(173):1054–1058.

[2] S Brunetto,R Massoud,et al.Digital droplet PCR (ddPCR) for the precise quantification of human T-lymphotropic virus 1 proviral loads in peripheral blood and cerebrospinal fluid of HAM/TSP patients and identification of viral mutations.Journal of Neurovirology. 2014, 20(4):341-351.

[3 ]H Doi,T Takahara,et al.Droplet Digital Polymerase Chain Reaction (PCR) Outperforms Real-Time PCR in the Detection of Environmental DNA from an Invasive Fish Species.Environmental Science Technology.2015, 49(9):5601-8.

[4] Kelley K S, Cosman A, Belgrader P, et al. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by a duplex droplet digital PCR assay[J]. Journal of clinical microbiology, 2013, 51(7): 2033-2039.

微滴式数字PCR系统聚合酶链反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

摘要:本文关于对沙眼衣原体和 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的检测。金黄色葡萄球菌(MRSA)是致盲的一个主要原因,文章对1509个临床样品进行了双重的ddPCR反应体系与金标准Roche Amplicor CT/NG进行了对比;MRSA从发现至今感染几乎遍及全球,已成为院内感染的重要病原菌之一,该文章对397个临床样品进行了双重的ddPCR反应体系与Roche 480定量PCR方法进行了对比,也是采用QX100进行细菌定量研究的首篇文献。

[5] Dodd D W, Gagnon K T, Corey D R. Digital quantitation of potential therapeutic target RNAs[J]. Nucleic acid therapeutics, 2013, 23(3): 188-194.

数字化定量分析潜在的治疗靶点RNA

摘要:近年来在小RNA的研究方面长非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)的研究成为热点,lncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子的总称。lncRNA的表达水平相对于编码蛋白的基因一般比较低,重要的是很多这些lncRNA虽然不直接参与基因编码和蛋白质合成,但是在基因转录后调控、剪切和修饰具有十分重要的功能,在很多生命活动中均起着举足轻重的作用,和疾病的发生、发展、诊断和治疗有密切的关系,迅速成为当今分子生物学最热门的前沿研究领域之一。

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数字PCR(digitalPCR,dPCR)是近年来引起重视并迅速发展 起来的一种突破性的定量分析技术。1992年Sykes等检测复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因时,利用样品的有限稀释,让每个孔中只获得单个模板分子,通过计算PCR后的扩增信号,以期准确地确定起始分子的数量,虽然没有明确提出“数字PCR”的概念,但是已经建立了数字PCR基本的实验流程,并且确定了数字PCR检测中一个极其重要的原则——以“终点信号的有或无”作为定量方法。这是数字PCR的雏形。1999年Vogelstein等在检测粪便中进行癌变组织脱离细胞的BRAF特异突变型基因时,因受到体细胞基因的干扰,而碰到检测灵敏度和检测分辨率的瓶颈,而采用了在384孔板中对每个反应孔的样品量进行极限稀释并增加反应孔数进行检测的方式,从而提出了数字式PCR的概念,同时也提出如果采用更多孔板其检测灵敏度会更高,从而指出了数字PCR系统的发展方向。

原理

标准PCR反应体系经过微滴发生后,分配到约20000个微滴中,每个微滴包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板),实现”单分子模板PCR扩增”,扩增结束后,含有核酸分子模板的微滴会给出荧光信号,没有模板的微滴就没有荧光信号产生。最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例,分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数,因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测;此外,由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态,因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点,完全不依赖于Ct值的鉴定,因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低,对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高;数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度。计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。

ddpcr

应用领域

领域具体方向
临床诊断无创产前诊断
癌症标志物检测
病毒检测
拷贝数变异分析
基因表达分析基因表达分析
单细胞基因表达分析
二代测序测序结果验证
测序文库质控
转基因成分定量转基因成分分析
微生物检测水样微生物检测
病原微生物检测

临床应用领域:

肿瘤早期筛查
微滴式数字PCR技术作为迄今为止最灵敏的检测肿瘤细胞突变DNA的手段,可有效应用于肿瘤的早期筛查。微滴式数字PCR技术可以通过检测患者外周血样对进入外周血循环的肿瘤组织核酸进行分析,相对于传统的PCR检测方法,有更高的灵敏度,可以更好的胜任稀有变异检测的工作,实验数据证实微滴式数字PCR可以实现0.001%的突变频率筛查。
肿瘤病理学辅助诊断
微滴式数字PCR的一个主要优势是所需样本量很低,这对于临床来说特别有意义,尤其是当病理样本太少时,DDPCR可以帮助检测突变,来辅助诊断对药物的敏感性。另外在肿瘤均质细胞内检测单一突变相对简单,但是如果在异质细胞内,在仅存有少量携带突变肿瘤细胞的情况下,突变的特定等位基因是否可以被准确检测到,直接影响到靶向治疗是否有效。微滴式数字PCR 在进行突变/稀有变异检测中发挥着重要的作用,是临床肿瘤样本靶向药物分子检测的不二之选。

肿瘤负荷的实时监控
微滴式数字PCR技术由于可以检测外周血循环细胞中微量肿瘤细胞突变DNA,成为进行肿瘤负荷实时监控的有效手段,判断患者体内肿瘤细胞负荷更加科学、可靠、及时。
药物耐药突变外周血监控
目前,许多肿瘤常规化疗效果差,预后不良是困扰临床的重要难题,而肿瘤多药耐药性则是肿瘤化疗失败的关键因素。经治疗后,残存的肿瘤干细胞耐药性形成,常导致对某些药物治疗敏感性降低,并引起肿瘤复发甚至转移,因此,对药物耐药突变的筛选和监控成为当今医学界研究的热点。

技术优势

通过把样本稀释成许多部分,然后在一个反应发生的时候对其进行计数。其灵敏度高达0.001%,显著高于扩增阻滞突变系统(0.1%)和Sanger法测序(10%)。同时能克服核酸降解的不利影响,非常适合一些稀有样本中核酸的精确检测。

1.高灵敏度、高特异性检测复杂背景下的靶标序列
灵敏度可达0.001%,样本珍贵或者样本核酸存在降解时的最佳选择。在穿刺样本、胸腹水、外周血中即可完成靶标序列的检测。
2.所需样本量少
200ul血浆或1ml全血/  2-3片白片/  纳克级活检组织。
3.实验数据分析便捷
每个微滴的检测结果以阴性、阳性判读,数据分析自动化。
4.可统计突变率
真正意义上的绝对定量,通过统计分析可得出靶点的突变率。

+ 技术参数

实验路线

ddpcr-process

实验仪器

QX200TMDroplet DigitalTM PCR

ddpcr2

送样要求

样品类型送样要求
DNA样本纯度OD260/280 比值为 1.6-1.8,浓度≥10 ng/μl,体积≥20μl,干冰运输
RNA样本纯度OD260/280 比值为 1.8-2.0,浓度≥20 ng/μl,体积≥20μl,干冰运输
血液样本样品为EDTA抗凝或枸椽酸钠抗凝,样品量大于0.5 ml,样品采集后于-20°C或-80°C保存,低温(≤-4°C)运输
组织样本样品可以为新鲜组织(最好-80°C保存)或石蜡包埋的组织,也可以是95%乙醇中固定的组织,组织量大于100 mg。干冰运输。

结果报告展示

ddpcr-analysis-results
+ 文献及案例

参考文献

[1] C Floren,I Wiedemann,et al.Species identification and quantification in meat and meat products using Droplet Digital PCR (ddPCR).Food Chemistry. 2015, 173(173):1054–1058.

[2] S Brunetto,R Massoud,et al.Digital droplet PCR (ddPCR) for the precise quantification of human T-lymphotropic virus 1 proviral loads in peripheral blood and cerebrospinal fluid of HAM/TSP patients and identification of viral mutations.Journal of Neurovirology. 2014, 20(4):341-351.

[3 ]H Doi,T Takahara,et al.Droplet Digital Polymerase Chain Reaction (PCR) Outperforms Real-Time PCR in the Detection of Environmental DNA from an Invasive Fish Species.Environmental Science Technology.2015, 49(9):5601-8.

[4] Kelley K S, Cosman A, Belgrader P, et al. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by a duplex droplet digital PCR assay[J]. Journal of clinical microbiology, 2013, 51(7): 2033-2039.

微滴式数字PCR系统聚合酶链反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

摘要:本文关于对沙眼衣原体和 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的检测。金黄色葡萄球菌(MRSA)是致盲的一个主要原因,文章对1509个临床样品进行了双重的ddPCR反应体系与金标准Roche Amplicor CT/NG进行了对比;MRSA从发现至今感染几乎遍及全球,已成为院内感染的重要病原菌之一,该文章对397个临床样品进行了双重的ddPCR反应体系与Roche 480定量PCR方法进行了对比,也是采用QX100进行细菌定量研究的首篇文献。

[5] Dodd D W, Gagnon K T, Corey D R. Digital quantitation of potential therapeutic target RNAs[J]. Nucleic acid therapeutics, 2013, 23(3): 188-194.

数字化定量分析潜在的治疗靶点RNA

摘要:近年来在小RNA的研究方面长非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)的研究成为热点,lncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子的总称。lncRNA的表达水平相对于编码蛋白的基因一般比较低,重要的是很多这些lncRNA虽然不直接参与基因编码和蛋白质合成,但是在基因转录后调控、剪切和修饰具有十分重要的功能,在很多生命活动中均起着举足轻重的作用,和疾病的发生、发展、诊断和治疗有密切的关系,迅速成为当今分子生物学最热门的前沿研究领域之一。

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