服务简介

分子量是有机化合物最基本的理化性质参数,正确与否往往代表着所测定的生物大分子的结构是否正确。MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱, 英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱。该方法不产生或产生较少的碎片离子。它可直接应用于混合物的分析,也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。

分子量也是生物大分子如多肽、蛋白质等鉴定中首要的参数,也是基因工程产品报批的重要数据之一。MALDI-TOF的准确度达0.1%~0.01%(经验值),高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术,是目前表征分析中不可或缺的一门技术。

案例

利拉鲁肽分子量测定

参数:

模式:Reflector positive ms                    质量扫描范围:800~4000Da

激光强度:4500                                      激光打点数量:1200 laser shots

质量误差:100ppm

测试结果:

利拉鲁肽样品(未酶切)

理论分子量[M+H]+:3749.95Da

maldi-tof

服务简介

蛋白大分子的N末端,C末端对于蛋白的结构稳定,功能,修饰都起着重大的作用。在药物结构确证分析中是必不可少的部分。

N端测序常见的方法为Edman降解法,但Edman降解法不能测出N端封闭,修饰等情况下的N端序列。质谱法N端可以克服这些不足,而且可以检测出对应的修饰,基本没有限制。

C末端没有类似Edman降解法类似的方式测序,国内外都基本认可和采用质谱法测试C末端,以及C末端修饰,如K丢失。

案例

凝血因子X激活剂

凝血因子X激活剂由3个亚基组成,实验对3个亚基分别进行序列覆盖率和N,C末端检测。

经Trypsin、Chymotrypsin与Glu-C 3种酶切后,上LC-MS检测鉴定。

结果

(1)alpha链

整合Trypsin、Chymotrypsin与Glu-C酶切鉴定结果所得综合覆盖率为:89%

nc1-1
nc1-2

N端1-14位氨基酸序列(L*************E)鉴定质谱图及序列匹配

(2)beta链

整合Trypsin、Chymotrypsin与Glu-C酶切鉴定结果所得综合覆盖率为:97%

nc2-1
nc2-2
nc2-3

N端1-20位氨基酸序列(L****************E)鉴定质谱图及序列匹配

C端122-134位氨基酸序列(R*********C)鉴定质谱图及序列匹配

(3)gamma链

整合Trypsin、Chymotrypsin与Glu-C酶切鉴定结果所得综合覆盖率为:100%

nc3-1
nc3-2
nc3-3

N端1-17位氨基酸序列(V****************K)鉴定质谱图及序列匹配

C端116-123位氨基酸序列(I*********F)鉴定质谱图及序列匹配

HPLC蛋白质纯度检测分析

服务简介

生物制品对产品纯度业内都有一个规定要求,对此纯度检测是一项基础和必要的检测项目。

HPLC(高效液相色谱)利用样品不同成分间的特殊理化性质在经过分离柱是产出不同的保留时间从而达到分离效果,同时通过不同的物质的出峰峰面积计算成分的所占百分比。一般常用的分离柱为反相柱,分子筛等等。

案例

色谱条件:流动相:A,2% ACN + 98% H2O + 0.1% TFA

B,98% ACN + 2% H2O + 0.1% TFA

色谱柱:C4-STⅡ  300Å  5μm  4.6×250mm  TechMate公司

波长:  λ=280nm

梯度: 

0-40min   20%B-50%B

40-45min   50%B-100%B

45-50min   100%B

50-53min   100%B-20%B

53-60min   20%B

分析测试结果

1号峰面积占比:94.2%

2号峰面积占比:1.6%

3号峰面积占比:4.2%

hplcchundu

HPLC肽段检测分析

服务简介

生物制品研发阶段与原研药或对照品同一性分析以及产品多批次之间稳定性分析是制药必不可少的一部分。HPLC肽段检测分析的原理是讲待检测样品通过特异性酶切之后检测酶解肽段特异性出峰图谱从而鉴定样品间的同一性,该检测项也是目前QC检验常用的方法。

案例

样品:尖吻蝮蛇血凝酶

酶切:胰酶

色谱条件: 流动相:A,2% ACN + 98% H2O + 0.1% TFA

B,98% ACN + 2% H2O + 0.1% TFA

色谱柱:C18-SD  300Å  5μm  4.6×250mm  TechMate公司

波长: λ=214nm

梯度:

0-45min   5%B-50%B

45-47min   50%B-95%B

47-52min   95%B

52-54min   95%B-5%B

54-60min   5%B

分析测试结果

hplc1
hplc2
hplc3

批号xxx样品3次平行肽图分析实验

批号xxx样品3次平行肽图分析实验

批号xxx样品3次平行肽图分析实验

服务简介

二硫键是蛋白质形成特定空间结构的重要化学键,在一条肽链上不同位置上的氨基酸之间形成二硫键,可以将肽链折叠成特定的空间结构。一个蛋白质分子可以由多个亚基组成,亚基之间也可通过二硫键相连,形成特定空间结构。二硫键与蛋白质高级结构的生物活性,复性都有关。故作为一种特殊的修饰,对其进行正确的鉴定对于生物药结构确证来说是至关重要的一部。

案例

rhNGF(重组人神经生长因子)二硫键分析

分析流程

disulfide-bonds-process

理论信息

Trypsin酶切后理论酶切肽段

Num  From-To     MH+     HPLC     pI           Sequence

1       1-  9         1067.54  16.56    10.85     SSSHPIFHR

2      10- 25       1712.77   22.01    3.74      GEFSVCDSVSVWVGDK

3      26- 32       749.40     8.23      6.50      TTATDIK

4      33- 34       204.13    1.40      10.15     GK

5      35- 50    1791.93    17.75   4.31      EVMVLGEVNINNSVFK

6      51- 57    962.46      17.97   6.67      QYFFETK

7      58- 59    277.12      8.41     9.55      CR

8      60- 69    1058.44    11.96   3.92      DPNPVDSGCR

9      70- 74    519.28      8.22     6.99      GIDSK

10     75- 88    1723.78    21.14    8.69     HWNSYCTTTHTFVK

11     89- 95     735.37     11.07    6.99     ALTMDGK

12     96-100    631.33     12.84   10.80   QAAWR

13     101-103   435.27    14.49    10.85   FIR

14    104-114    1177.57   21.53    5.95    IDTACVCVLSR

15    115-115    147.11     1.09      9.47    K

16    116-117    189.12     2.24      6.97    AV

二硫键理论配对信息

Cys15与Cys80配对

Cys58与Cys108配对

Cys68与Cys110配对

检测C-C

1.证明 C15-C80存在

2.证明 C58-C108和C68-C110存在

经计算二硫键肽段理论分子量与Trypsin理论酶切肽段分子量无相近及干扰。

结果

检测到C-C连接肽段1

disulfide-bonds-result1
disulfide-bonds-result2

图中可见1718.27(2+)

1719.27(2+)二级图谱

disulfide-bonds-result3
disulfide-bonds-result4

图中可见1145.85(3+)

1146.52(3+)二级图谱

检测到C-C连接肽段2

disulfide-bonds-result5
disulfide-bonds-result6

图中可见1256.06(2+)

1256.56(3+)二级图谱

disulfide-bonds-result7
disulfide-bonds-result8

图中可见837.71(3+)

838.04(3+)二级图谱

N糖分析(糖蛋白分子量,糖占比,糖谱)

服务简介

含有不同结构糖基的蛋白其生理活性是不同的,对生物制品,如单抗,唾液酸成分对其功能有着重要的影响。比如末端结构为唾液酸的静脉注射免疫球蛋白所占比例低于4%。而恰恰是含有唾液酸的静脉注射免疫球蛋白是治疗抗炎症的有效成分。对糖的占比,结构等研究越来越成为业内人士的关注点。

技术策略:通过MALDI-TOF/TOF质谱对用PNGase-F酶处理前后的样品进行分子量检测,计算切掉N-糖前后的分子量差在整个蛋白分子量中的占比,从而客观评价N-糖含量。再通过C18石墨柱对PNGase-F酶处理后的样品进行N-糖糖链的富集,并用MALDI-TOF/TOF质谱检测和GlycoWorkBench软件分析,得到N-糖糖谱结果。

案例

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)

1):蛋白分子量及N糖含量占比检测结果

N-糖基化修饰占比结果(单电荷)如下:

n1

N-糖基化修饰占比结果(双电荷)如下:

n2

样品**********未切除N-糖修饰样品质谱图

经过六次质谱检测计算。样品分子量为61060.8939±23.6825Da

样品**********切除N-糖修饰样品质谱图

经过六次质谱检测计算。样品分子量为55316.4805±37.1819Da

n3
n4

2):糖型分析

将糖型分子量使用ExPASy-Glycomod Tool分析参数设置:

Mass tolerance:±0.2Da

positive:[M+Na]+    

N-linked oligosaccharide:Free/PNGase released oligosaccharides

结果显示样品N-糖样本中共检测到11类N-糖结构均为二天线结构,部分发生岩藻糖基化。

n5

1N-乙酰氨基葡萄糖胺

甘露糖

半乳糖

岩藻糖

注:图中结构不涉及单糖间的连接方式

N糖基化位点分析

技术策略:先用PNGase-F酶切除蛋白中的N-连接糖,再选用2种及以上的不同酶对蛋白进行酶切,质谱检测。在高覆盖率并覆盖到理论N-糖基化修饰位点的前提下,数据检索发现N-糖基化修饰位点的0.984Da质量漂移。从而确定N-糖基化修饰位点的存在。

案例

样品名称:rhTPO(重组人血小板生成素)

rhTPO通过序列预测,共有6个N-糖基化修饰位点。

结果:

通过Trypsin、Chymotrypsin与Glu-C 3种酶切后,序列覆盖率为82%。其中共找到5个N-糖基化修饰位点。

n6
n7

T**************PN176R

T*********TN185F********R

n8
n9

I***********N213Q****R

LN319T********Y

n10

T*******QN327L*****G

本服务可满足获取单克隆抗体未知序列信息的需求。

氨基酸序列的准确性,是进一步生产研发的基础。因此,我们的服务在抗体测序的各环节都按照最严格的标准进行。

1、多酶酶解:使用更多的蛋白酶联合酶解,只为更深度序列交叠,更多重的测序信息。

2、高精数据:我们使用Orbitrap Fusion质谱进行分析。三倍于其它服务商的质谱使用成本,只为更丰富的碎片、更灵敏的信号,更坚实的数据基础。

3、正交算法:不同于其它服务商仅使用单一维度算法,我们使用“Dynamic Programming”、“Kinetic Fragmentation”、“Knuth-Morris-Pratt”等多种算法完成数据解析与检验。更多精力,更多算法,只为正确的测序结果。

(注意:对于非抗体类蛋白,同样提供测序服务。)

mab-sequencing-process
[]
1 Step 1
在线留言
姓名:
单位:
手机号:
地址:
您的留言:
0 /
Previous
Next
+ 分子量

服务简介

分子量是有机化合物最基本的理化性质参数,正确与否往往代表着所测定的生物大分子的结构是否正确。MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱, 英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱。该方法不产生或产生较少的碎片离子。它可直接应用于混合物的分析,也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。

分子量也是生物大分子如多肽、蛋白质等鉴定中首要的参数,也是基因工程产品报批的重要数据之一。MALDI-TOF的准确度达0.1%~0.01%(经验值),高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术,是目前表征分析中不可或缺的一门技术。

案例

利拉鲁肽分子量测定

参数:

模式:Reflector positive ms                    质量扫描范围:800~4000Da

激光强度:4500                                      激光打点数量:1200 laser shots

质量误差:100ppm

测试结果:

利拉鲁肽样品(未酶切)

理论分子量[M+H]+:3749.95Da

maldi-tof
+ N端/C端

服务简介

蛋白大分子的N末端,C末端对于蛋白的结构稳定,功能,修饰都起着重大的作用。在药物结构确证分析中是必不可少的部分。

N端测序常见的方法为Edman降解法,但Edman降解法不能测出N端封闭,修饰等情况下的N端序列。质谱法N端可以克服这些不足,而且可以检测出对应的修饰,基本没有限制。

C末端没有类似Edman降解法类似的方式测序,国内外都基本认可和采用质谱法测试C末端,以及C末端修饰,如K丢失。

案例

凝血因子X激活剂

凝血因子X激活剂由3个亚基组成,实验对3个亚基分别进行序列覆盖率和N,C末端检测。

经Trypsin、Chymotrypsin与Glu-C 3种酶切后,上LC-MS检测鉴定。

结果

(1)alpha链

整合Trypsin、Chymotrypsin与Glu-C酶切鉴定结果所得综合覆盖率为:89%

nc1-1
nc1-2

N端1-14位氨基酸序列(L*************E)鉴定质谱图及序列匹配

(2)beta链

整合Trypsin、Chymotrypsin与Glu-C酶切鉴定结果所得综合覆盖率为:97%

nc2-1
nc2-2
nc2-3

N端1-20位氨基酸序列(L****************E)鉴定质谱图及序列匹配

C端122-134位氨基酸序列(R*********C)鉴定质谱图及序列匹配

(3)gamma链

整合Trypsin、Chymotrypsin与Glu-C酶切鉴定结果所得综合覆盖率为:100%

nc3-1
nc3-2
nc3-3

N端1-17位氨基酸序列(V****************K)鉴定质谱图及序列匹配

C端116-123位氨基酸序列(I*********F)鉴定质谱图及序列匹配

+ 蛋白纯度/肽段

HPLC蛋白质纯度检测分析

服务简介

生物制品对产品纯度业内都有一个规定要求,对此纯度检测是一项基础和必要的检测项目。

HPLC(高效液相色谱)利用样品不同成分间的特殊理化性质在经过分离柱是产出不同的保留时间从而达到分离效果,同时通过不同的物质的出峰峰面积计算成分的所占百分比。一般常用的分离柱为反相柱,分子筛等等。

案例

色谱条件:流动相:A,2% ACN + 98% H2O + 0.1% TFA

B,98% ACN + 2% H2O + 0.1% TFA

色谱柱:C4-STⅡ  300Å  5μm  4.6×250mm  TechMate公司

波长:  λ=280nm

梯度: 

0-40min   20%B-50%B

40-45min   50%B-100%B

45-50min   100%B

50-53min   100%B-20%B

53-60min   20%B

分析测试结果

1号峰面积占比:94.2%

2号峰面积占比:1.6%

3号峰面积占比:4.2%

hplcchundu

HPLC肽段检测分析

服务简介

生物制品研发阶段与原研药或对照品同一性分析以及产品多批次之间稳定性分析是制药必不可少的一部分。HPLC肽段检测分析的原理是讲待检测样品通过特异性酶切之后检测酶解肽段特异性出峰图谱从而鉴定样品间的同一性,该检测项也是目前QC检验常用的方法。

案例

样品:尖吻蝮蛇血凝酶

酶切:胰酶

色谱条件: 流动相:A,2% ACN + 98% H2O + 0.1% TFA

B,98% ACN + 2% H2O + 0.1% TFA

色谱柱:C18-SD  300Å  5μm  4.6×250mm  TechMate公司

波长: λ=214nm

梯度:

0-45min   5%B-50%B

45-47min   50%B-95%B

47-52min   95%B

52-54min   95%B-5%B

54-60min   5%B

分析测试结果

hplc1
hplc2
hplc3

批号xxx样品3次平行肽图分析实验

批号xxx样品3次平行肽图分析实验

批号xxx样品3次平行肽图分析实验

+ 二硫键

服务简介

二硫键是蛋白质形成特定空间结构的重要化学键,在一条肽链上不同位置上的氨基酸之间形成二硫键,可以将肽链折叠成特定的空间结构。一个蛋白质分子可以由多个亚基组成,亚基之间也可通过二硫键相连,形成特定空间结构。二硫键与蛋白质高级结构的生物活性,复性都有关。故作为一种特殊的修饰,对其进行正确的鉴定对于生物药结构确证来说是至关重要的一部。

案例

rhNGF(重组人神经生长因子)二硫键分析

分析流程

disulfide-bonds-process

理论信息

Trypsin酶切后理论酶切肽段

Num  From-To     MH+     HPLC     pI           Sequence

1       1-  9         1067.54  16.56    10.85     SSSHPIFHR

2      10- 25       1712.77   22.01    3.74      GEFSVCDSVSVWVGDK

3      26- 32       749.40     8.23      6.50      TTATDIK

4      33- 34       204.13    1.40      10.15     GK

5      35- 50    1791.93    17.75   4.31      EVMVLGEVNINNSVFK

6      51- 57    962.46      17.97   6.67      QYFFETK

7      58- 59    277.12      8.41     9.55      CR

8      60- 69    1058.44    11.96   3.92      DPNPVDSGCR

9      70- 74    519.28      8.22     6.99      GIDSK

10     75- 88    1723.78    21.14    8.69     HWNSYCTTTHTFVK

11     89- 95     735.37     11.07    6.99     ALTMDGK

12     96-100    631.33     12.84   10.80   QAAWR

13     101-103   435.27    14.49    10.85   FIR

14    104-114    1177.57   21.53    5.95    IDTACVCVLSR

15    115-115    147.11     1.09      9.47    K

16    116-117    189.12     2.24      6.97    AV

二硫键理论配对信息

Cys15与Cys80配对

Cys58与Cys108配对

Cys68与Cys110配对

检测C-C

1.证明 C15-C80存在

2.证明 C58-C108和C68-C110存在

经计算二硫键肽段理论分子量与Trypsin理论酶切肽段分子量无相近及干扰。

结果

检测到C-C连接肽段1

disulfide-bonds-result1
disulfide-bonds-result2

图中可见1718.27(2+)

1719.27(2+)二级图谱

disulfide-bonds-result3
disulfide-bonds-result4

图中可见1145.85(3+)

1146.52(3+)二级图谱

检测到C-C连接肽段2

disulfide-bonds-result5
disulfide-bonds-result6

图中可见1256.06(2+)

1256.56(3+)二级图谱

disulfide-bonds-result7
disulfide-bonds-result8

图中可见837.71(3+)

838.04(3+)二级图谱

+ 糖分析

N糖分析(糖蛋白分子量,糖占比,糖谱)

服务简介

含有不同结构糖基的蛋白其生理活性是不同的,对生物制品,如单抗,唾液酸成分对其功能有着重要的影响。比如末端结构为唾液酸的静脉注射免疫球蛋白所占比例低于4%。而恰恰是含有唾液酸的静脉注射免疫球蛋白是治疗抗炎症的有效成分。对糖的占比,结构等研究越来越成为业内人士的关注点。

技术策略:通过MALDI-TOF/TOF质谱对用PNGase-F酶处理前后的样品进行分子量检测,计算切掉N-糖前后的分子量差在整个蛋白分子量中的占比,从而客观评价N-糖含量。再通过C18石墨柱对PNGase-F酶处理后的样品进行N-糖糖链的富集,并用MALDI-TOF/TOF质谱检测和GlycoWorkBench软件分析,得到N-糖糖谱结果。

案例

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)

1):蛋白分子量及N糖含量占比检测结果

N-糖基化修饰占比结果(单电荷)如下:

n1

N-糖基化修饰占比结果(双电荷)如下:

n2

样品**********未切除N-糖修饰样品质谱图

经过六次质谱检测计算。样品分子量为61060.8939±23.6825Da

样品**********切除N-糖修饰样品质谱图

经过六次质谱检测计算。样品分子量为55316.4805±37.1819Da

n3
n4

2):糖型分析

将糖型分子量使用ExPASy-Glycomod Tool分析参数设置:

Mass tolerance:±0.2Da

positive:[M+Na]+    

N-linked oligosaccharide:Free/PNGase released oligosaccharides

结果显示样品N-糖样本中共检测到11类N-糖结构均为二天线结构,部分发生岩藻糖基化。

n5

1N-乙酰氨基葡萄糖胺

甘露糖

半乳糖

岩藻糖

注:图中结构不涉及单糖间的连接方式

N糖基化位点分析

技术策略:先用PNGase-F酶切除蛋白中的N-连接糖,再选用2种及以上的不同酶对蛋白进行酶切,质谱检测。在高覆盖率并覆盖到理论N-糖基化修饰位点的前提下,数据检索发现N-糖基化修饰位点的0.984Da质量漂移。从而确定N-糖基化修饰位点的存在。

案例

样品名称:rhTPO(重组人血小板生成素)

rhTPO通过序列预测,共有6个N-糖基化修饰位点。

结果:

通过Trypsin、Chymotrypsin与Glu-C 3种酶切后,序列覆盖率为82%。其中共找到5个N-糖基化修饰位点。

n6
n7

T**************PN176R

T*********TN185F********R

n8
n9

I***********N213Q****R

LN319T********Y

n10

T*******QN327L*****G

+ 抗体测序

本服务可满足获取单克隆抗体未知序列信息的需求。

氨基酸序列的准确性,是进一步生产研发的基础。因此,我们的服务在抗体测序的各环节都按照最严格的标准进行。

1、多酶酶解:使用更多的蛋白酶联合酶解,只为更深度序列交叠,更多重的测序信息。

2、高精数据:我们使用Orbitrap Fusion质谱进行分析。三倍于其它服务商的质谱使用成本,只为更丰富的碎片、更灵敏的信号,更坚实的数据基础。

3、正交算法:不同于其它服务商仅使用单一维度算法,我们使用“Dynamic Programming”、“Kinetic Fragmentation”、“Knuth-Morris-Pratt”等多种算法完成数据解析与检验。更多精力,更多算法,只为正确的测序结果。

(注意:对于非抗体类蛋白,同样提供测序服务。)

mab-sequencing-process
+ 联系我们
[]
1 Step 1
在线留言
姓名:
单位:
手机号:
地址:
您的留言:
0 /
Previous
Next